实验原理/Experimental principle
本产品基于差速离心原理，利用不同细胞组分在离心力场中沉降系数的差异实现线粒体的分离富集。首先使用低渗分离缓冲液使细胞吸水膨胀，配合温和匀浆或反复吹打机械破碎细胞膜，在等渗条件下释放线粒体、细胞核、细胞碎片等亚细胞结构，保持线粒体结构和功能的完整性；随后通过低速离心去除未破碎细胞及细胞核，上清中含有线粒体、溶酶体、过氧化物酶体等组分；最后通过中速离心富集线粒体沉淀，上清为胞浆组分。提取的线粒体蛋白建议使用Bradford 蛋白定量试剂盒或BCA蛋白定量试剂盒（货号：BQK001/BQK003）。
技术流程/Procedure
一、细胞准备
收集贴壁细胞或悬浮细胞（推荐1-5×10⁷个细胞），4°C、500 × g离心5-10分钟，弃上清。用预冷PBS洗涤细胞1-2次，离心后弃上清，尽量吸尽残留液体。
二、试剂准备
将线粒体分离缓冲液从-20°C取出，冰上解冻，预冷备用。临用前向分离缓冲液中加入蛋白酶抑制剂（如PMSF，终浓度1 mM），混匀备用。
三、细胞破碎
按每20 μL细胞沉淀加入200-500 μL分离缓冲液的比例，加入预冷分离缓冲液，轻轻重悬细胞。冰上孵育10-15分钟，使细胞膨胀。使用匀浆器或玻璃组织研磨器进行温和匀浆（约20-40次），或反复吹打至约80-90%细胞破碎（镜下观察）。
注意：避免过度匀浆，以免线粒体破裂。
四、差速离心分离线粒体
将匀浆液转移至预冷离心管中，4°C、600-1,000 × g离心5-10分钟，去除细胞核及未破碎细胞。小心吸取上清（含线粒体），转移至新的预冷离心管中。4°C、6,000-12,000 × g离心10-20分钟，富集线粒体。弃上清，保留沉淀（线粒体），上清为胞浆组分。
五、线粒体洗涤（可选）
加入适量预冷分离缓冲液重悬线粒体沉淀。4°C、6,000-12,000 × g离心10-15分钟，弃上清。
六、线粒体裂解（如需提取线粒体蛋白）
向线粒体沉淀中加入RIPA裂解液或线粒体专用裂解液（每10⁷个细胞来源的线粒体加入50-100 μL）。冰上裂解20-30分钟，期间轻轻振荡。4°C、12,000 × g离心10分钟，取上清即为线粒体蛋白。
七、定量与保存
使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。分装后置于-20°C或-80°C保存，避免反复冻融。
产品优势/Highlights
✪ 分离清晰
高效分离完整线粒体，胞浆及其他细胞器；
✪ 保护活性
温和操作条件配合保护剂，有效维持线粒体膜电位、呼吸链功能及酶活性；
✪ 即用便捷
常规低温离心机即可，约1小时内获得活性线粒体。